Начало исследований в этом направлении было положено работой Меибери и Катца (1956). Они впервые показали стабилизирующее действие D2O при сопоставлении скорости денатурации яичного альбумина мочевиной в Н2O и D2O. Затем Гилд и ван Туберген (1957) установили то же по отношению к нагреву. В дальнейшем стабилизирующий эффект D2O был получен на многих глобулярных и фибриллярных белках как при действии нагрева, так и в отношении других денатурирующих и протеолитических воздействий (см.: «Денько, 1970; Лобышев, Калиниченко, 1978; Lemm, Wenzel, 1981, и др.). При замене Н2О на D2O температура тепловой денатурации белков повышается обычно на 3-6 °С. По-видимому, единственным исключением является лиэоцим, стабильность которого в Н2О и D2O) почти одинакова.
В белковых макромолекулах имеются группировки атомов, водород которых быстро обменивается на дейтерий, и группы, водород которых в обычных условиях практически не обменивается; к первым относятся группы NH4, ОН, SH, ко вторым — группы СН. Скорость замещения способных к обмену атомов Н на D в белке зависит от стерической доступности первых. Она может быть использована для оценки конформационной подвижности белковых макромолекул. Установлено, что стабилизирующий эффект выявляется в белках лишь в том случае, если водород в группах СН не замещается дейтерием. Белки, в которых водород, связанный с атомами углерода, замещен дейтерием, можно получить из организмов, длительно живших в среде с тяжелой водой. Такие белки оказываются дестабилизированными и температура термической денатурации у них ниже, чем у гомологичных протиевых белков. Полностью дейтерированные белки менее устойчивы и к мочевине; они также быстрее перевариваются протеиназами. Однако в дейтерированной и недейтерированной белок в D2O более теплоустойчив, чем в Н2O.
Что касается механизмов дестабилизации белков в D2O, то этот вопрос оказался гораздо более сложным, чем это представлялось первым его исследователям. Так, Германс и Шерага (1959), Ригби (1962) и другие приписывали стабилизирующее действие D2O повышению прочности водородных связей, крепящих пространственную структуру белковых макромолекул, при замене в ней Н на D. Для подтверждения этого объяснения было выполнено большое количество работ, которые, однако, подвергались критике. Авторы сводки признают вопрос об изменении прочности водородных связей нерешенными и считают, что ответственными за стабилизацию белка при замене Н2O на D2O могут быть помимо водородных связей гидрофобные и солевые взаимодействия и связанная вода. На основании ряда фактов Лобышев и Калиниченко особое значение придают последней: «Увеличение теплоустойчивости белка в тяжелой воде объясняется большей прочностью связи с поверхностью макромолекул тяжелой воды по сравнению с обычной».
Вскоре после того, как стало известно антиденатурирующее действие D2O, были предприняты опыты по выявлению влияния тяжелой воды на устойчивость растительных (эпидермис листа Campanula persicifolia.), животных (мерцательный эпителий неба лягушки) клеток и глицеринизированных моделей мерцательных клеток по отношению к нагреву и высокому гидростатическому давлению. Во всех случаях частичная замена в среде Н2O на D2O повышала устойчивость клеток к нагреву (разница достигала 3 °С) и к высокому гидростатическому давлению. Одновременна и независимо Дщеревский и Корниенко (1964) показали, что тяжелая вода стабилизирует скелетные мышцы лягушки по отношению к нагреву. В этих работах было обнаружено, что стабилизирующий эффект получается чрезвычайно быстро. Для мышц достаточно минутного соприкосновения клеток с тяжелой водой; в наших опытах клетки мерцательного эпителия лягушки повышали свою теплоустойчивость через 1 с после погружения в тяжелую воду. Учитывая столь быстрое действие D2O, трудно объяснить вызываемую ею стабилизацию заменой атомов водорода в белках на дейтерий. Однако ее можно объяснить тем, что тяжелая вода отличается от легкой как растворитель.
В дальнейшем начали накапливаться многочисленные данные, демонстрирующие повышение термостабильности животных, растительных, бактериальных клеток и изолированных из них компонентов в среде, содержащей D2O (Денько, 1970; Raaphorst, Azzam, 1982; Fisher et al., 1982, и др.).
Таким образом, закономерность молекулярного уровня в непреломленном виде проявляется и на уровне клеточном. Более того, Паттендрих и Косбей (1974) показали проявление этой закономерности и на организменном уровне. Они сравнивали устойчивость к нагреву мух Drosophila pseudoobscura, которым после предварительного голодания давали пить обычную подсахаренную воду, с устойчивостью мух, получавших волу, содержащую 15 или 25% D2O. При 3-минутном нагреве до 39 °С мухи, напившиеся дейтерированной воды, гибли в меньшем числе, чем утолявшие жажду обычной водой. Повышение теплоустойчивости мух удавалась уловить уже через 10 минут после 10-минутного питья подсахаренной воды, содержащей D2O. Авторы приписывают полученный результат стабилизирующему действию D2O на белки организма.
Следующий шаг был сделан в работе В.Я.Александрова, проведенной совместно с лабораторией сравнительной генетики поведения Института физиологии АН СССР. В этой работе выяснялось влияние D2O на теплолюбивость мух Drosophila melanogaster. Для этого мухи после предварительного голодания получали подслащенную воду, либо обычную, либо содержащую 50% D2O. Прежде всего мухи были испытаны на теплоустойчивость. В соответствии с данными Питтендриха и Косбей мухи, напившиеся тяжелой воды, действительно оказались теплоустойчивее. При 39 °С средний срок их жизни был существенно большим, чем у контрольных мух (38,1 и 23,9 мин соответственно). Для определения предпочитаемой температуры контрольные мухи и мухи, получившие 50% D2O, помещались в горизонтально лежащие стеклянные трубочки с температурным градиентом. Затем регистрировалась дислокация мух в трубочках. Изучено усредненное распределение мух по температурному градиенту. Полученные результаты с несомненностью показывают, что у мух, пивших воду с D2O, выше, чем у контрольных, получивших обычную воду, не только теплоустойчивость, но и теплолюбивость. Они предпочитают находиться при более высокой температуре. Точка максимального скопления дейтерированных мух лежит на 2,5° С выше, чем мух, пивших обычную воду. Таким образом, тяжелая вода смещает показания биологического термометра мух в холодную сторону.